对于阳离子纳米颗粒，生物流体中自发的纳米颗粒-蛋白质冠形成和聚集会引发意想不到的生物反应。有鉴于此，加拿大工程院陈璞院士团队提出了一种用单蛋白或双蛋白伪装阳离子肽/siRNA纳米复合物（P/Si）的仿生策略，该策略利用内源性蛋白的独特特性，稳定阳离子P/Si复合物，实现安全和靶向递送。在此基础上，选择丰富的人血清白蛋白（HSA）和载脂蛋白AI（Apo-AI）构建了仿生HSA修饰的P/Si（P/Si@HSA)和双蛋白（HSA和Apo-AI）修饰的P/Si（P/Si@HSA_Apo)，因为双蛋白伪装在有效递送中起到了互补的作用。该研究还为siRNA递送量身定制了支链阳离子肽（b-HKR），并通过精确的微流体技术制备了它们的纳米复合物，包括阳离子P/Si和仿生蛋白质修饰的P/Si。仿生阴离子蛋白伪装大大增强了P/Si的生物稳定性和生物相容性，为克服阳离子纳米粒子在生物流体和系统递送中的应用限制提供了可靠的策略。相关工作以Engineering Biomimetic Protein Camouflage for Delivering Peptide/siRNA Nanocomplexes为题发表在Journal of the American Chemical Society。
文章介绍：
该项研究假设在生物系统中，蛋白冠的形成是蛋白质弱化或中和外源纳米粒的化学（如表面电荷、化学组成与活性基团）与物理性质（如表面自由能与热力学特征）的过程，以维持相对稳态环境。因此，基于高通量蛋白质组学研究，这些自发形成的蛋白冠且具有某些递送功能的蛋白质可以作为潜在的仿生蛋白冠。设计仿生蛋白冠的基本逻辑是利用已鉴定的相应纳米粒的蛋白冠组份，制备一系列的仿生蛋白冠稳定化的纳米粒，为安全有效的递送提供更多的选择；而不是将阳离子或原始纳米粒直接应用于生物体液中。
文章首先对分支肽/siRNA纳米复合物（P/Si）在各种生物基质中的稳定性进行了研究，发现所制备的P/Si虽然在去离子水中是纳米尺寸（90~180nm，粒径可通过改变微流控的流速调节），但在生理盐水、细胞培养基、血清、尤其是人血浆等生物介质中快速聚集而形成微米级。这种现象广泛存在于阳离子纳米复合物，主要由于电解质导致的Zeta电位（双电层结构）破坏以及纳米粒的非特异性吸附。为了更全面的解释这种现象并从仿生的角度解决这个问题，该研究对P/Si蛋白冠（P/Si-PC）的形成进行了深入分析（图1），并对P/Si与相应蛋白的结合进行了验证。
图 1. （a）SDS-PAGE分析从牛血清（FBS）分离的P/Si-PC（FBS）；（b）SDS-PAGE比较P/Si-PC（FBS）与从人血浆（HP）分离的P/Si-PC（HP），并切取明显的区别条带进行LC-MS/MS分析。（c）P/Si-PC（HP）中丰度前50蛋白的KEGG通路图
通过对P/Si-PC中蛋白组份的鉴定与验证，发现转铁蛋白对于P/Si的结合系数相对较弱，只能形成“松”蛋白冠；而HSA与Apo-AI的结合系数比较强，形成“紧”蛋白冠。另外，在一定浓度范围与条件下，HSA能使P/Si稳定化，使其在盐溶液与生物基质中保持稳定。该文章对P/Si-PC中蛋白质的等电点（pI）进行了统计分析，发现大多数P/Si-PC蛋白组份的pI值分布在5.5~6.5，表明这些蛋白质在正常生理条件下带负电荷，而在酸性条件下（例如，在内吞体或溶酶体中pH 5.0~6.5）转变为电中性甚至带正电荷。这些蛋白冠组份在不同环境中电荷的改变为构建pH响应型仿生蛋白冠提供了基础。
基于上述研究，该文章以HSA与Apo-AI为仿生蛋白冠，利用微流控技术制备了P/Si@HSA以及P/Si@HSA_Apo。研究表明，在生理条件下P/Si@HSA以及P/Si@HSA_Apo具有很好的稳定性；而在酸性条件下，恢复P/Si的正电性并快速聚集。对于仿生蛋白冠的构建与应用，需要权衡纳米粒的稳定性与有效性的最佳点（即生物稳定性与相容性显着提高的同时，最大限度地保持原纳米粒P/Si的RNAi活性）。与P/Si相比，P/Si@HSA的RNAi效果显著减弱，而在MCF7细胞系中，P/Si@HSA_Apo与P/Si的RNAi效果无显著差异（图2）。这些结果说明双蛋白仿生蛋白冠的优势和必要性。
图 2. （a）P/Si@HSA细胞摄取与逃逸荧光成像；（b）流式细胞术评价A549细胞的摄取效率；（c）利用tM值计算Cy3-siRNA与LysoTracker共定位；（d）内吞抑制剂对细胞摄取的影响；（e）P/Si纳米复合物在A549和MCF7细胞上的基因沉默效率
该研究所展示的pH响应型仿生蛋白冠的构建方法可适用于其他纳米粒，特别是对于那些具有高毒性和窄治疗指数的递送系统。该方法可根据不同的目的，在不改变原纳米粒表面结构或性质的基础上设计各种仿生蛋白冠。
文章链接：
https://doi.org/10.1021/jacs.4c00691
